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预防性补充婴儿双歧杆菌或其代谢产物肌苷减轻心肌缺血再灌注损伤
研究论文
● 期刊: iMeta (IF 23.7)
● 原文链接DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.220
●2024年7月2日，中国科学院宋默识和王军团队在iMeta在线发表了题为“Prophylactic supplementation with Bifidobacterium infantis or its metabolite inosine attenuates cardiac ischemia/reperfusion injury”的文章。
● 本研究研究发现Bifidobacterium infantis或其代谢产物肌苷对于心肌缺血再灌注损伤，具有抑制心脏炎症和减少细胞死亡的双重保护作用，为急性缺血性心脏疾病的防治提供了新思路和新策略。
● 第一作者：张浩、王佳琬、沈江华
● 通讯作者：宋默识([email protected])、王军([email protected])
● 合作作者：陈思琪、袁海龙、张旋、刘续、于莹、李欣然、高泽宇、王耀辉
● 主要单位：中国科学院动物研究所、中国科学院微生物研究所、首都医科大学附属北京朝阳医院、河南大学
亮 点
● 婴儿双歧杆菌作为一种广泛使用的益生菌，其预防性补充对小鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用；
● 婴儿双歧杆菌对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护效果可由其代谢产物肌苷复现；
● 肌苷可导致树突状细胞和自然杀伤细胞的数量减少，从而降低心肌缺血再灌注损伤引起的心脏炎症反应；
● 肌苷可作为碳源，通过嘌呤补救合成途径生成ATP，从而减轻心肌缺血再灌注损伤引起的心脏细胞死亡。
摘 要
越来越多的研究表明，肠道微生物群通过多种代谢产物对心血管疾病的发生发展产生显著影响。该研究采用心肌缺血/再灌注（I/R）损伤动物模型，发现预防性给予益生菌——婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis, B. infantis）可在I/R后显著保护心脏，维持其收缩功能并抑制心脏的结构重塑，此保护作用主要由其代谢产物肌苷（inosine）介导。转录组学分析显示，肌苷可以减轻I/R引发的心脏炎症和细胞死亡。机制研究表明，肌苷通过激活腺苷A2A受体，抑制促炎细胞因子产生，并降低树突状细胞和自然杀伤细胞数量；当该受体被抑制时，肌苷则不再具有心脏保护作用。此外，细胞实验表明，在模拟心肌缺血再灌注损伤的氧糖剥夺/复氧条件下，肌苷可作为替代碳源，通过嘌呤补救途径生成ATP，减少细胞死亡，并能逆转I/R导致的小鼠心脏ATP水平下降。综上所述，该研究发现B. infantis或其代谢产物肌苷对于心肌缺血再灌注损伤，具有抑制心脏炎症和减少细胞死亡的双重保护作用，为急性缺血性心脏疾病的防治提供了新思路和新策略。
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全文解读
引 言
心血管疾病（CVD），包含缺血性心脏病（IHD）与卒中，虽然近年来临床治疗手段上不断进步进步，但这些疾病仍是全球人口高发病和死亡的主要原因。鉴于心血管疾病不断进展的特点，为这类病患探寻有效的预防与治疗手段十分迫切。心肌梗死（MI）是心血管疾病中最严重的类型之一，常伴随缺血/再灌注（I/R）损伤的并发症。此类损伤约占所有心肌梗死病例的一半，多发生在经皮冠状动脉介入治疗和溶栓治疗后，涉及多重复杂因素，如代谢紊乱、炎症、氧化应激及微血管阻塞等。心肌梗死与I/R损伤所带来的全球健康挑战，凸显出我们对新颖、高效治疗策略的迫切需求。
近期越来越多的研究开始强调肠—心轴的重要性，揭示肠道微生物组及其代谢产物与心血管疾病间存在错综复杂的联系，所涉及的疾病谱系广泛，涵盖高血压、心力衰竭乃至心肌梗死等。肠道微生物组不仅能产生三甲胺（TMA）、短链脂肪酸（SCFA）、胆汁酸和琥珀酸等关键代谢产物，还能通过调节包括调节性T细胞（Treg）、先天淋巴细胞（ILC）和巨噬细胞在内的免疫细胞，对宿主的免疫和炎症反应起到调控作用。已有研究表明，肠道微生物能够塑造宿主的免疫环境，并影响代谢和免疫疾病的发病与进展。在卒中患者中，肠道微生物群能通过免疫细胞调节影响患者预后。鉴于肠道微生物群在调控宿主代谢和免疫功能中的核心地位，益生菌在预防或治疗多种疾病中展现出的潜力备受关注。动物双歧杆菌、加氏乳杆菌和植物乳杆菌等益生菌菌株不仅应用于乳制品发酵，还在治疗肥胖、非酒精性肝病和II型糖尿病等方面表现出显著疗效。新型益生菌如嗜黏蛋白阿克曼菌亦在代谢紊乱的人类临床试验中展现出积极效果。然而，目前对于益生菌在心肌梗死和I/R损伤中的保护作用仍知之甚少，需进一步深入探索。
双歧杆菌属作为哺乳动物肠道微生物群的核心组成部分，已被广泛证实其在缓解便秘、腹痛、胀气等消化不适症状方面的显著功效。这种疗效主要归因于其能够有效恢复肠道菌群平衡，并抑制食物残渣的异常细菌发酵。值得关注的是，多项研究指出心肌梗死患者体内双歧杆菌属的丰度显著降低。婴儿双歧杆菌（B. infantis）作为一种广泛应用的益生菌，不仅展现出对致病性感染的抵抗能力，还能显著减轻胃肠道疾病（如溃疡性结肠炎）和非胃肠道疾病（例如慢性疲劳综合征和银屑病）相关的炎症反应，显示出其在疾病状态下的抗炎潜力。与健康人群相比，冠心病患者体内双歧杆菌的丰度较低，然而，婴儿双歧杆菌对冠心病预后之间的联系，特别是在心肌缺血再灌注（I/R）损伤情境下的作用仍需要进一步的研究与探索。
在本研究中，我们深入探讨了婴儿双歧杆菌在心肌缺血再灌注（I/R）损伤小鼠模型中的心脏保护效果。结果表明，婴儿双歧杆菌对心肌I/R损伤展现出显著的保护作用，这一效应主要由其代谢产物肌苷产生。肌苷不仅有效抑制了心脏炎症反应，还显著减少了心肌细胞死亡。因此，本研究有力证实了婴儿双歧杆菌或其代谢产物肌苷在治疗心肌I/R损伤方面的潜在临床应用价值，为其作为新型治疗手段的开发提供了有力的证据。
结 果
婴儿双歧杆菌灌胃有助于减轻缺血再灌注后的心脏损伤
既往研究已探明婴儿双歧杆菌的抗炎与代谢调节功效。我们的研究进一步探索了婴儿双歧杆菌对心脏的保护作用，特别是对抗急性缺血性心脏损伤的效果。我们选取8周龄雄性C57BL/6J小鼠，首先通过连续7天抗生素灌胃清除其肠道微生物群（图1A）。随后，对小鼠进行为期7天的婴儿双歧杆菌（2×107 CFU/天）或PBS（对照组）灌胃处理。通过16S rDNA定量分析，我们证实了婴儿双歧杆菌在小鼠肠道中的成功定植（p < 0.001）（图1B-C）。为诱导心肌缺血再灌注（I/R）损伤，我们对小鼠左前降支冠状动脉进行40分钟的结扎，随后恢复血液供应。同时，设置假手术组作为对照。术后7天观察结果显示，与假手术组相比，接受PBS灌胃的I/R小鼠心室扩张现象显著，心脏重量与体重比增加50%（p < 0.001），心脏重量与胫骨长度比也显著增加（p < 0.001）。然而，在婴儿双歧杆菌灌胃的I/R小鼠中，这种心室扩张得到显著缓解，表现为心脏重量与体重比以及心脏重量与胫骨长度比的增加幅度均明显降低（p < 0.01，p < 0.01）（图1D）。
此外，在术后1周（图1E-F）和2周（图S1A-B）的超声心动图检测中，我们发现婴儿双歧杆菌灌胃的I/R小鼠相比PBS灌胃的I/R小鼠，其心脏功能保留情况更好。具体来说，婴儿双歧杆菌灌胃的I/R小鼠左心室射血分数百分比（LVEF%）和左室短轴缩短率（LVFS%）均显著高于对照组（LVEF%在1周和2周时均p < 0.001，LVFS%在1周和2周时均p < 0.01）。同时，这些小鼠的左室舒张末期内径（LVEDD）和左室收缩末期内径（LVESD）也均明显降低（LVEDD在1周时p < 0.05，2周时p < 0.001；LVESD在1周时p < 0.05，2周时p < 0.001）（图1E-F）。这些结果充分表明，婴儿双歧杆菌灌胃对于预防左心室扩张及保留心脏功能具有显著效果。
图1. 婴儿双歧杆菌灌胃减轻了小鼠心肌缺血/再灌注（I/R）后的心脏损伤
（A）实验设计示意图。雄性C57BL/6J小鼠在心肌缺血再灌注（I/R）操作前，先接受7天的抗生素预处理以清除其肠道微生物群，随后进行连续7天的婴儿双歧杆菌灌胃。在I/R前7天和后7天收集血清样本，同时在I/R前14天、前7天和后7天收集粪便样本。此外，在基线、I/R前7天、I/R前3天、后7天和后14天，我们通过经胸超声心动图（Echo）对小鼠的心脏功能进行检测。（B）抗生素（ABX）处理前后粪便中的细菌16S rDNA拷贝数，数据以平均值 ± 标准误差表示，每组n = 4。双因素方差分析，***p < 0.001。（C）婴儿双歧杆菌灌胃7天前后小鼠粪便中的婴儿双歧杆菌拷贝数，数据以平均值 ± 标准误差展示，每组n = 4。其中，ns代表差异不显著；经双因素方差分析，***p < 0.001。（D）心脏重量与体重比（HW/BW）和心脏重量与胫骨长度比（HW/TL），数据呈现为平均值 ± 标准误差，每组n = 10。经单因素方差分析与Tukey检验，**p < 0.01；***p < 0.001。（E）图展示了基线和I/R后7天的代表性超声心动图图像。（F）I/R后7天的左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）、左心室舒张末期内径（LVEDD）和左心室收缩末期内径（LVESD）的定量数据，数据以平均值 ± 标准误差表示。其中，假手术组（Sham）n = 12；PBS灌胃的I/R组（PBS + I/R）n = 12；婴儿双歧杆菌灌胃的I/R组（B. infantis + I/R）n = 11。经单因素方差分析与Dunnett检验，*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。B. infantis代表婴儿双歧杆菌；I/R代表缺血/再灌注；LAD代表左前降支。
婴儿双歧杆菌灌胃减轻缺血/再灌注后的心脏损伤
心肌缺血/再灌注的组织学特征研究对于深入理解从梗死初期、再灌注到慢性纤维化的形态学变化及其病理生理学机制至关重要。为了详细探讨这一过程，我们对经过缺血/再灌注处理并分别接受婴儿双歧杆菌和PBS灌胃的小鼠心脏组织进行了组织病理学检查。通过天狼星红（PSR）染色和马松三色染色，我们观察到，在缺血/再灌注并进行PBS灌胃的小鼠心脏样本中，瘢痕区域显著扩大，且纤维化组织更为密集（p < 0.001）。相反，在婴儿双歧杆菌灌胃的小鼠心脏缺血/再灌注样本中，瘢痕大小和纤维化组织的量均明显减少（p < 0.01）（图2A-B）。此外，我们的研究还发现，婴儿双歧杆菌灌胃能够有效减少缺血/再灌注诱导的心肌细胞死亡。具体来说，与假手术组相比，缺血/再灌注并PBS灌胃的小鼠心脏组织中，TUNEL阳性率大幅上升（p < 0.001），表明心肌细胞死亡增多。然而，在婴儿双歧杆菌灌胃的缺血/再灌注小鼠中，心脏组织的TUNEL阳性率显著降低（p < 0.01）（图2C-D），表明婴儿双歧杆菌对心肌细胞具有保护作用。同时，我们还检测了心肌细胞损伤的标志物—心肌肌钙蛋白T（cTnT）的水平。结果显示，缺血/再灌注后，cTnT水平显著升高（p < 0.01），但婴儿双歧杆菌灌胃后，其水平明显下降（p < 0.05）。这一发现进一步支持了婴儿双歧杆菌在减轻心肌缺血-再灌注损伤中的积极作用。
图2. 婴儿双歧杆菌灌胃减少了心肌缺血/再灌注后小鼠的心脏纤维化和细胞凋亡
（A）缺血/再灌注手术7天后，梗死区域边界处心脏组织的中心室截面天狼星红（PSR）染色（上图）和马松（Masson’s staining）三色染色（下图）。PSR染色中，红色区域代表胶原。比例尺，1 mm。在马松染色中，蓝色信号表示纤维化区域。比例尺，100 μm。（B）纤维化面积量化。数据呈现为平均值 ± 标准误差；每组n = 5。**p < 0.01；***p < 0.001（单因素方差分析与Tukey检验）。（C）共染TUNEL（绿色）和细胞核（蓝色）评估小鼠心脏中的细胞凋亡凋亡情况。比例尺，50 μm。（D）在200倍放大率下，每个视野中的平均凋亡细胞数情况。每组n = 6；**p < 0.01；***p < 0.001（单因素方差分析与Tukey检验）。（E）缺血/再灌注后3天小鼠血清cTnT的ELISA检测。每组n = 6。*p < 0.05；**p < 0.01（单因素方差分析与Tukey检验）。TUNEL，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记；DAPI，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚。
肌苷复现了婴儿双歧杆菌对缺血/再灌注后的心脏保护作用
既往研究表明，婴儿双歧杆菌能大量产生并分泌肌苷，我们推测肌苷在婴儿双歧杆菌对心脏的保护机制中可能起关键作用。为验证该假设，我们首先观察了抗生素处理对小鼠血清肌苷水平的影响，但结果未见显著差异（图S2）。接下来，我们比较了缺血/再灌注损伤小鼠在PBS灌胃与婴儿双歧杆菌后的肌苷水平。结果表明，相较于PBS灌胃的小鼠，婴儿双歧杆菌灌胃的小鼠血清和心脏组织中肌苷水平显著提高（p < 0.01和p < 0.001，图3A）。这一发现支持了我们的推测，即肌苷在婴儿双歧杆菌的心脏保护作用中扮演重要角色。
为了探究肌苷对缺血/再灌注小鼠的心脏是否具有保护作用，我们通过腹腔注射的方式展开研究（图3B）。实验结果发现，腹腔注射肌苷能产生与婴儿双歧杆菌灌胃类似的心脏保护效果。具体来说，肌苷显著抑制了由缺血/再灌注引发的心室扩张。缺血/再灌注后，小鼠的心脏重量与体重比（HW/BW）以及心脏重量与胫骨长度比（HW/TL）均显著增加（p < 0.001），但经过肌苷处理后，这两个比例均显著降低（p < 0.001）（图3C）。此外，我们发现缺血/再灌注导致小鼠血清中的cTnT浓度显著增加（p < 0.001），而肌苷治疗则能有效降低这一浓度（p < 0.01）（图3D）。同时，肌苷还能有效缓解缺血/再灌注导致的心脏功能障碍，显著提升LVEF百分比（p < 0.001）和LVFS（p < 0.01），并显著降低LVEDD（p < 0.05）和LVESD（p < 0.01）（图3E-F）。利用马松三色染色技术，我们发现缺血/再灌注小鼠的心脏样本中纤维化组织增多（p < 0.001），但在肌苷处理后的小鼠心脏中，这些纤维化组织明显减少（p < 0.01）（图3G）。总结来说，我们的数据明确显示，肌苷能够重现婴儿双歧杆菌在对抗缺血/再灌注损伤过程中的心脏保护作用。
图3. 肌苷复现了婴儿双歧杆菌对抗缺血/再灌注的心肌保护作用
（A）在连续7天婴儿双歧杆菌灌胃后，采用高效液相色谱-质谱联用法检测了血清（左图）和心脏组织（右图）中的肌苷水平。婴儿双歧杆菌灌胃显著提升了血清和心脏组织中的肌苷含量。数据以平均值 ± 标准误差表示。血清检测中，PBS灌胃组n = 8，婴儿双歧杆菌灌胃组n = 9。**p < 0.01（Student’s t检验）。在心脏组织检测中，假手术组n = 5，PBS灌胃组n = 7，婴儿双歧杆菌灌胃组n = 9。***p < 0.001（Student’s t检验）。（B）小鼠肌苷处理实验的设计方案。雄性C57BL/6J小鼠在缺血/再灌注前7天开始接受腹腔注射肌苷治疗，之后每天注射一次，持续至缺血/再灌注后7天。我们在缺血/再灌注前后通过超声心动图监测了心脏功能，并在特定时间点收集了血清和心脏组织样本。（C）心脏重量与体重比（HW/BW）及心脏重量与胫骨长度比（HW/TL）。数据以平均值 ± 标准误差表示。假手术组（Sham）n = 7，注射PBS的缺血/再灌注组（PBS + I/R）n = 6，注射肌苷的缺血/再灌注组（Inosine + I/R）n = 8。***p < 0.001（单因素方差分析与Dunnett's检验）。（D）ELISA测定缺血/再灌注后3天小鼠血清中的cTnT水平。结果显示，肌苷治疗显著降低了cTnT浓度。假手术组（Sham）n = 5，注射PBS的缺血/再灌注组（PBS + I/R）n = 6，注射肌苷的缺血/再灌注组（Inosine + I/R）n = 7。**p < 0.01；***p < 0.001（单因素方差分析与Dunnett's检验）。（E）基线时和缺血/再灌注后7天的代表性超声心动图图像。（F）对LVEF、LVFS、LVEDD和LVESD进行了定量分析。数据显示，肌苷治疗显著改善了这些心脏功能指标。数据以平均值 ± 标准误差表示。假手术组（Sham）n = 6，注射PBS的缺血/再灌注组（PBS + I/R）n = 9，注射肌苷的缺血/再灌注组（Inosine + I/R）n = 8。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001（单因素方差分析与Dunnett's检验）。（G）通过马松三色染色技术观察了缺血/再灌注手术后7天小鼠的心脏组织。蓝色信号代表纤维化区域。比例尺，2mm。右侧的量化数据显示，肌苷治疗显著减少了心脏纤维化。数据以平均值 ± 标注误表示；每组n = 5。**p < 0.01；***p < 0.001（单因素方差分析与Tukey检验）。i.p.，腹腔注射。
转录组分析显示肌苷在心脏缺血/再灌注后能改善能量代谢并抑制免疫反应与细胞凋亡
为了更好地探究肌苷治疗对心脏缺血/再灌注（I/R）损伤的保护机制，我们在缺血/再灌注后的1天内，对经过肌苷处理的I/R组、PBS处理的I/R组以及假手术组的小鼠心脏组织进行了转录组分析（图4A）。结果显示，在注射PBS的I/R组中，有2682个基因表达上调，2906个基因表达下调（图4B）。值得注意的是，其中827个因I/R上调的基因和1263个因I/R下调的基因，在肌苷治疗后表达均恢复正常（图4C,D）。随后，我们利用GO富集分析，进一步明确了肌苷治疗主要影响的生物学过程（图4E）。在显著上调的前10个通路中，有8个与脂肪酸分解代谢密切相关。这表明肌苷能有效逆转由I/R引发的不良代谢重编程，即阻止从脂肪酸代谢向糖酵解的转变。此外，通过基因集富集分析（GSEA），我们发现肌苷能显著改善缺血/再灌注后受损的心脏能量代谢。具体而言，原本在缺血/再灌注后呈现下调趋势的脂肪酸代谢，在肌苷治疗后得到显著恢复（图4F，图S3A）。与此过程相关的基因，如Ces1d、Acad11、Cpt2、Ehhadh和Acadm的表达变化，也进一步印证了肌苷的治疗效果（图S3B）。
另一方面，在肌苷治疗主要下调的10个通路中，有9个与炎症反应紧密相关，如细胞因子介导的信号传导和白细胞间粘附。这一发现揭示了肌苷具有抗炎的心脏保护作用（图4E）。GSEA数据进一步显示，缺血/再灌注后原本上调的炎症相关细胞因子，在肌苷治疗后得到了有效下调（图4G，图S3A）。支持这一观察的相关基因包括Trem1、Il1b、Il6、Inava和Il18r1，它们的表达变化为此提供了确凿的证据（图S3C）。同时，GSEA数据还表明，缺血/再灌注后上调的细胞凋亡过程，在肌苷的作用下也受到了显著抑制（图4H，图S3A）。与此相关的基因，例如Bcl2a1a、Pmaip1、Traf1、Bid和Tnfrsf10b的表达模式，进一步印证了这一发现（图S3D）。综上所述，通过深入的转录数据分析，我们发现肌苷能够通过改善能量代谢、减轻心脏炎症以及抑制细胞凋亡，为心脏提供全面而有效的保护。
图4. 转录分析的结果表明，在接受I/R手术并辅以肌苷治疗的小鼠心脏中，能量代谢得到了显著的改善，同时免疫反应也受到了有效的抑制
（A）主成分分析（PCA）显示组内聚类，显示了良好的样本区分度。（B）火山图显示Sham和PBS + I/R组（左图）之间以及Inosine + I/R组和PBS + I/R组（右图）之间鉴定的差异表达基因。蓝点表示基因表达下调，红点表示基因表达上调，灰点表示无统计学差异的基因表达。| Fold change | > 2，校正后p值 < 0.05。（C）左图，Venn图显示PBS + I/R组和Sham组相比显著上调的基因，与Inosine + I/R组和PBS + I/R组相比显著下调的基因之间的重叠基因。右图，Venn图示PBS + I/R组和Sham组相比显著下调的基因，与Inosine + I/R组和PBS + I/R组相比显著上调的基因之间的重叠基因。差异表达基因的临界值|Fold change| > 2，校正后p值 < 0.05。（D）PBS + I/R组与Sham组相比差异表达基因的表达水平热图，以及Inosine + I/R组与PBS + I/R组相比被Inosine逆转表达的差异基因的表达水平热图。每个基因的表达水平由从蓝色（低）到红色（高）的颜色范围表示。（E）左图为富集排名前10的GO-BP，即在I/R组和Sham组比较下调的基因，而在Inosine + I/R组和PBS + I/R组比较上调的基因（红色）。右图列出了在I/R组和Sham组比较上调的基因，而在Inosine + I/R组和PBS + I/R组比较下调（蓝色）的基因富集排名前10的基因。（F-H）基因集富集分析（GSEA）图显示，Inosine + I/R组与PBS + I/R组比较，差异表达基因的基因集主要富集在（F）脂肪酸代谢途径，（G）细胞因子产生的正向调节，和（H）细胞凋亡。
肌苷通过激活腺苷A2A受体（A2AR），有效抑制了缺血/再灌注后小鼠心脏炎症反应
肌苷通过激活腺苷A2A受体（A2AR），有效抑制了缺血/再灌注后小鼠心脏的促炎反应，进而显著减轻了心脏炎症。心脏炎症是一个由多种细胞因子和免疫细胞共同参与的复杂过程，对病理生理的调节以及缺血再灌注心脏的预后具有深远影响。因此，调控炎症反应被视为治疗心肌梗死后心脏损伤及提升心脏功能的重要策略。基于本研究的RNA测序数据，我们发现肌苷在缺血再灌注（I/R）后展现出显著的抗炎效果。为了进一步验证这一发现，我们深入探究了白细胞介素-1β（IL-1β）的表达情况。IL-1β是在I/R过程中早期并持续上调的关键促炎细胞因子。研究结果显示， I/R诱导的Tnf mRNA水平上升，同时，通过免疫组织化学染色，我们观察到IL-1β的表达也显著增加（p ＜ 0.001）。然而，在经过肌苷治疗后，这些增加均得到了显著下调（p ＜ 0.01）（图5A,B，图S4）。同样值得注意的是，通过ELISA方法检测，我们发现循环中的促炎细胞因子IL-1β和白细胞介素-6（IL-6）的浓度在I/R后的第1天和第7天均显著上升（p ＜ 0.001，p ＜ 0.01）。但经过肌苷治疗后，IL-1β和IL-6的浓度均显著降低（p ＜ 0.001，p ＜ 0.01，p ＜ 0.05）（图5C）。这些结果充分证实了肌苷能有效降低I/R后的心脏及全身性炎症反应水平。
为了深入了解肌苷治疗在减轻缺血再灌注（I/R）引发的炎症反应中的具体作用机制，我们对小鼠心脏中的免疫细胞进行了流式细胞术分析。该分析在I/R后的第1天（图S5A-B）和第7天（图5D，图S5C）进行。结果显示，在I/R后的第1天，心脏组织中中性粒细胞（CD45+CD11b+ Ly6Ghigh）和CD11b+巨噬细胞（CD45+CD11b+F4/80+）的比例显著上升（p ＜ 0.05）。值得注意的是，在这一阶段，肌苷治疗并未显著影响这两类细胞的占比。然而，到I/R后的第7天，与仅接受PBS治疗的I/R组相比，肌苷治疗的I/R组的中性粒细胞和CD11b+巨噬细胞的占比均呈下降趋势（p值分别为0.0711和0.1542）。此外，我们还发现，树突状细胞（DCs，标记为CD45+CD11c+I-Ab+Ly6C-Ly6G-）和自然杀伤细胞（NK，标记为CD45+NK1.1+CD3-）在I/R后数量显著增加（p ＜ 0.05）。而经过肌苷治疗后，这两种细胞的增殖受到了显著抑制（p ＜ 0.05）（图5D，图S5C）。这些发现进一步证实了肌苷在心脏经历I/R后，对多种免疫细胞类型具有显著的抗炎效果。
既往研究表明，肌苷可通过腺苷受体（ARs）发挥其广泛的抗炎和免疫调节作用。鉴于腺苷A2A受体（A2AR）是在中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞（DCs）、自然杀伤细胞（NK）及自然杀伤T细胞（NKT）等多种免疫细胞上表达的主要AR类型，我们推测肌苷可能是借助A2AR来发挥其功效的。为了验证这一假设，我们在进行I/R手术之前给予小鼠A2AR的抑制剂ZM241385（简称A2ARi）。实验结果显示，在A2AR被抑制的情况下，肌苷无法为I/R小鼠心脏提供保护作用（图5E-F）。随后，我们采用酶联免疫吸附测定（ELISA）技术对血清中的促炎细胞因子IL-1β和IL-6进行了检测，结果显示肌苷治疗未能降低这些细胞因子的浓度（图5G）。这一发现进一步支持了我们的观点，即肌苷在减轻I/R小鼠心脏损伤和抑制炎症反应方面的作用的确依赖于A2AR的激活。
图5. 肌苷通过激活抗炎性A2AR受体减少I/R后心脏的炎症
（A）小鼠心脏组织中IL-1β的免疫组织化学染色代表性图。棕色信号表示细胞阳性表达IL-1β。比例尺，50 μm。（B）I/R后小鼠心脏组织中IL-1β的定量结果。数据呈现为平均值 ± 标准误差，每组n = 3。**p < 0.01；***p < 0.001（单因素方差分析与Tukey检验）。（C）ELISA检测I/R后第1天和第7天的血清中IL-1β（左图）及IL-6（右图）水平。每组n = 4。*p < 0.05，**p < 0.01；***p < 0.001（单因素方差分析与Tukey检验）。（D）I/R后第7天中性粒细胞、CD11b + 巨噬细胞（macs）、树突状细胞（DCs）和自然杀伤细胞（NK cells）的定量结果。数据呈现为平均值 ± 标准误差。假手术组（Sham），n = 3；PBS灌胃的I/R组（PBS + I/R），n = 4；给予肌苷的I/R组（Inosine + I/R），n = 5。ns代表不显著；* p < 0.05；** p < 0.01（单因素方差分析与Dunnett′s检验）。（E）I/R后第7天基线和代表性超声心动图图像。（F）右侧为LVFS、LVEDD和LVESD的定量结果，数据呈现为平均值 ± 标准误差。假手术组（Sham），n = 6；PBS灌胃的I/R组（PBS + I/R），n=8；肌苷处理的I/R组（Inosine + I/R），n = 8；肌苷和A2Ari处理组（Inosine + A2ARi + I/R），n = 5。ns代表不显著；*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001（单因素方差分析与Dunnett′s检验）。（G）I/R后第7天ELISA检测血清中炎性细胞因子IL-1β和IL-6。肌苷治疗的I/R组（Inosine + I/R），n = 4；肌苷和A2Ari处理组（Inosine + A2ARi + I/R），n = 5。*p < 0.05；***p < 0.001（Student’s t检验）。DCs代表树突细胞；NK cells细胞代表自然杀伤细胞；A2ARi代表A2AR抑制剂（ZM241385）。
肌苷在嘌呤补救途径中作为ATP生成的替代补充源，有助于减轻心肌细胞的死亡
根据我们的RNA测序数据，我们发现肌苷在治疗缺血再灌注（I/R）时，除了可以调节心脏炎症外，还能显著抑制I/R导致的心肌细胞凋亡，进而减轻心脏损伤。研究结果显示，相较于假手术组，注射PBS的I/R小鼠心脏组织TUNEL阳性率显著增加（p < 0.001），表明心肌细胞凋亡严重。然而，在给予肌苷治疗的I/R小鼠中，心脏组织的TUNEL阳性率显著降低（p < 0.001），这进一步证明了肌苷治疗能够有效减少由I/R引发的心肌细胞死亡（图6A）。为了深入探究肌苷如何保护小鼠心脏免受I/R后的心肌细胞死亡，我们采用了体外模型C2C12成肌细胞，并通过氧糖剥夺/复氧（OGDR）来模拟体内的I/R损伤（图6B）。实验结果显示，肌苷在保护C2C12成肌细胞免受OGDR损伤方面具有剂量依赖性的抗凋亡作用（图6C）。为了更明确地了解肌苷的保护机制，我们引入了两种针对肌苷不同下游途径的药理学抑制剂。结果表明，在OGDR条件下，肌苷能够显著降低C2C12成肌细胞的死亡率，并提高细胞的存活率（p < 0.001）。值得注意的是，这一保护效果并不受A2AR抑制剂（即ZM241385）的影响（p = 0.4126和p = 0.4507）（图S6），这表明A2AR通路的阻断并未削弱肌苷的保护作用。然而，当我们使用forodesine（一种嘌呤核苷磷酸化酶PNP抑制剂，能在细胞内将肌苷转化为次黄嘌呤和核糖-1-磷酸R1P）时，发现它显著削弱了肌苷的抗凋亡作用（p < 0.001，p < 0.01）（图6D，图S6）。这一发现证实了肌苷的抗细胞凋亡作用是通过其分解代谢途径来介导的。
先前研究表明，次黄嘌呤核苷和核糖-1-磷酸（R1P）可参与嘌呤补救途径，有助于恢复ATP储备。为了深入探索可能的分解代谢路径，我们采用siRNA技术特异性敲低某些关键酶，研究各代谢过程，并评估这些过程的中断对肌苷在OGDR条件下C2C12成肌细胞中促存活作用的影响。我们的研究结果显示，无论是磷酸葡萄糖变位酶2（Pgm2）（p = 0.9981）还是磷酸核糖焦磷酸合成酶1（Prps1）（p = 0.7907）的siRNA介导抑制，对肌苷在C2C12成肌细胞中的促存活效应均无明显影响。然而，当通过siRNA敲低次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hprt1）（p < 0.001）或腺嘌呤磷酸核糖转移酶（Aprt）（p < 0.001）这两种嘌呤补救途径的关键酶时，肌苷的促存活作用完全丧失（图6E，图S7A-D）。这一发现提示我们，肌苷的抗凋亡功能可能是通过转化为中间代谢产物，参与嘌呤补救途径生成ATP来实现的。进一步研究发现，向C2C12成肌细胞中添加肌苷后，单磷酸腺苷（AMP）水平显著上升（p < 0.001）（图6F）。同时，添加肌苷后，经受氧糖剥夺/复氧（OGDR）的C2C12成肌细胞中的ATP水平也显著增加（p < 0.001）；但使用嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）抑制剂阻止肌苷分解代谢时，ATP水平提升效应被阻断（p < 0.001）（图6G）。
综上所述，我们的实验数据表明，在C2C12成肌细胞经受氧糖剥夺/复氧（OGDR）损伤时，肌苷能有效作为ATP生成的替代能源。它通过嘌呤补救途径促进ATP的合成，从而发挥其抗细胞凋亡的作用。为了进一步验证肌苷在缺血再灌注（I/R）期间是否能作为有效的替代能源，我们对不同实验组别的梗死心脏组织中的ATP水平进行了检测。研究结果显示，与假手术组（Sham组）相比，小鼠心脏在缺血以及再灌注后的12小时内，ATP水平显著降低（图6H）。然而，在再灌注后的30分钟和24小时两个时间点，接受肌苷治疗的I/R小鼠心脏中的ATP水平，相较于PBS灌胃的I/R小鼠，有显著提升（p < 0.001，p < 0.01）（图6I-J）。这一发现证实在经历I/R后，肌苷能够通过维持心脏组织中的ATP水平，有效改善能量代谢状况。我们的研究数据支持了这样一个结论：肌苷可以作为经历I/R小鼠心脏中的有效替代能源，减少心肌细胞的死亡。
图6. 肌苷能够作为嘌呤补救途径中ATP生成的替代能源，以有效地减少心肌细胞的死亡
（A）I/R小鼠心脏梗死边缘区域的凋亡心肌细胞评估，这些细胞通过TUNEL（绿色）和心肌肌钙蛋白T（红色）的双重染色进行标记。比例尺为50 μm，定量数据呈现为平均值 ± 标准误差，每组n = 6，***p < 0.001（单因素方差分析与Tukey检验）。（B）C2C12成肌细胞中氧糖剥夺/复氧（OGDR）的诱导过程及肌苷处理方法的示意图。（C）在不同浓度的肌苷处理下，无论是在常氧环境还是OGDR条件下，均采用Alamar Blue对C2C12成肌细胞的活力进行了检测，每组n = 6， **p < 0.01；***p < 0.001（Student’s t检验）。（D）PI/Calcein-AM染色技术检测常氧和OGDR条件下，经过肌苷、DMSO及forodesine处理的C2C12成肌细胞的死亡情况，每组n = 3。ns代表无显著差异；***p < 0.001（双因素方差分析）。（E）在OGDR条件下利用siRNA技术敲低与嘌呤补救途径相关的基因，并用肌苷、DMSO及forodesine对C2C12成肌细胞进行处理，并通过PI/Calcein-AM染色技术测量细胞死亡情况，每组n = 5。ns代表无显著差异；***p < 0.001（单因素方差分析与Tukey检验）。（F）在OGDR条件下检测有或无肌苷存在时C2C12成肌细胞中AMP的水平，每组n = 6，***p < 0.001（Student’s t检验）。（G）在OGDR条件下检测在肌苷、DMSO及forodesine处理后的C2C12成肌细胞中的ATP水平，每组n = 5。ns代表无显著差异；***p < 0.001（单因素方差分析与Tukey检验）。（H）肌苷治疗组在IR后不同时间点心脏组织中的ATP水平检测，每组n = 6。数据呈现为平均值 ± 标准误差。ns代表无显著差异；*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001（Student’s t检验）。（I-J）I/R后30分钟（I）和I/R后24小时（J）心脏组织中的ATP水平的检测，每组n = 10。数据呈现为平均值 ± 标准误差。ns代表无显著差异；**p < 0.01；***p < 0.001（单因素方差分析与Tukey检验）。PI，碘化丙啶；DMSO，二甲亚砜；AMP，一磷酸腺苷；ATP，三磷酸腺苷。
讨 论
在本研究中，我们发现了一种被广泛使用的益生菌—婴儿双歧杆菌，在减轻心肌缺血再灌注（I/R）后的心脏损伤方面具有显著疗效。研究结果显示，婴儿双歧杆菌能有效缓解I/R导致的心脏损伤，具体体现在减少细胞凋亡和抑制炎症反应上，展现了其多方面的治疗优势。同时，我们观察到婴儿双歧杆菌灌胃后，I/R小鼠血液中的肌苷浓度显著提升。令人振奋的是，肌苷能够模拟婴儿双歧杆菌对I/R小鼠的心脏保护效应。转录组学分析结果进一步支持了肌苷能有效减轻I/R诱导的炎症并降低心肌细胞死亡率。深入研究其作用机理后，我们发现肌苷能通过经典的腺苷A2A受体调节免疫细胞（例如树突状细胞和自然杀伤细胞）的活性。此外，肌苷还能通过嘌呤补救途径提高ATP水平，表现出抗凋亡的特性。综上所述，本研究为治疗心肌I/R损伤提供了全新的预防策略，即通过服用婴儿双歧杆菌或其代谢产物肌苷来达到保护心脏的目的。
心脏代谢在心肌梗死（MI）后的缺血再灌注（I/R）治疗中扮演着至关重要的角色。在I/R过程中，心脏代谢会发生显著变化，具体表现为心脏细胞内的关键能量底物如脂肪酸迅速减少，同时有害的代谢中间产物和活性氧（ROS）会积聚，这些因素可能进一步加剧细胞损伤和引发炎症反应。为了应对这些代谢障碍，研究人员已提出激活多种生物途径，如糖酵解、葡萄糖氧化、酮体氧化、己糖胺生物合成及去乙酰化等，以恢复I/R后的心脏代谢平衡。同时，补充关键能量物质如ATP、肌苷和腺苷也被证实能有效保护心脏功能，其机制在于刺激缺血环境下的腺嘌呤再合成。我们的研究结果进一步揭示，肌苷能够通过细胞内流进入嘌呤补救途径，从而提升应激状态下的心肌细胞ATP水平，促进ATP的生成。此外，有研究表明，肌苷还能激活其他组织（如棕色脂肪细胞）的能量消耗，有助于调节能量平衡，并可能改善肥胖和糖尿病等代谢紊乱状况，这些紊乱是心血管疾病的重要风险因素。综合这些已有发现和我们的研究结果，我们推测，对高危心肌梗死患者给予婴儿双歧杆菌及其代谢产物肌苷，可能会带来短期和长期的健康益处。这一推测为心肌梗死患者的治疗提供了新的思路和方法。
我们的研究发现，肌苷不仅对缺血再灌注（I/R）心肌细胞具有抗凋亡作用，还可通过调控与I/R相关的免疫细胞来发挥抗炎作用。肌苷治疗虽未改变I/R后巨噬细胞的数量或极化状态，但显著降低了促炎细胞因子（如IL-1β和IL-6）的水平。此外，肌苷还大幅减少了树突状细胞（DC）和自然杀伤细胞（NK）等其他免疫细胞的数量。值得注意的是，DC细胞会响应梗死后心肌的坏死组织，引发自身免疫反应和炎症。然而，肌苷调控这些免疫细胞实现心脏保护的具体机制尚待进一步探究。另外，我们的研究还表明，预防性使用路氏乳杆菌或其代谢产物γ-氨基丁酸（GABA）可减轻巨噬细胞介导的心脏炎症，从而改善I/R后的心脏功能。综上所述，这些研究为肠道菌群治疗在I/R中的应用提供了新思路，益生菌与传统治疗的结合可能有助于降低心肌损伤，改善患者预后。
我们的研究仍然存在一些局限性。尽管先前的研究表明，除了婴儿双歧杆菌（B. infantis）外，长双歧杆菌（Bifidobacterium pseudolongum）等其他细菌也能产生肌苷，这可能有助于加强免疫检查点阻断剂的抗肿瘤作用。然而，仍需进一步探讨以明确，是单独使用婴儿双歧杆菌，还是将其与其他菌株联合使用，才是基于肌苷的益生菌补充的最佳且可行的方式。此外，由于单独使用婴儿双歧杆菌或肌苷只能在一定程度上恢复缺血再灌注（I/R）后的心脏功能，因此未来的研究应重点探讨婴儿双歧杆菌与肌苷的联合使用是否能产生更显著的心脏保护作用。最后，关于婴儿双歧杆菌或肌苷在其他心血管疾病（如慢性心力衰竭）中可能的保护作用，目前尚不明确，因此这一领域也值得进一步深入研究。
总之，我们的研究显示了预防性补充婴儿双歧杆菌及其代谢产物肌苷在急性心肌梗死后减轻缺血再灌注损伤的保护作用，并揭示肌苷既对免疫细胞，尤其是树突状细胞（DC）和自然杀伤细胞（NK细胞）具有抗炎作用，又可作为碳源提高ATP水平从而缓解缺血再灌注后心肌细胞死亡。这项研究为婴儿双歧杆菌及其代谢产物肌苷在预防和潜在治疗心肌缺血再灌注损伤甚至更广泛的心血管疾病中的转化应用提供了关键见解，也为将婴儿双歧杆菌及其代谢产物肌苷应用于其他炎症和代谢相关问题提供了重要基础。
方 法
实验动物
本研究中所用小鼠均购自斯贝福生物技术有限公司（中国北京），均为8至10周龄的雄性C57BL/6J品系。小鼠饲养于SPF级动物设施，维持12小时光照周期，并提供经高压灭菌的垫料。此外，本研究所有动物实验均已经中国科学院动物研究所机构护理与伦理委员会严格审批并授权。
抗生素给药方案与婴儿双歧杆菌菌株处理
本研究采用特定抗生素给药方案以清除小鼠胃肠道内微生物群。将万古霉素（0.125mg/mL/天，货号1404-94-9，Sigma-Aldrich，美国）、新霉素（0.25mg/mL/天，货号1405-10-3，麦克林，中国）、甲硝唑（0.25mg/mL/天，货号443-48-1，索莱宝，中国）及氨苄西林（0.25mg/mL/天，货号7177-48-2，索莱宝，中国）混合于饮用水中，供小鼠自由饮用，持续7天。为改善混合药水口感，另添加阿斯巴甜（0.1mg/mL/天，货号A801109，麦克林，中国）。混合抗生素给药结束后，将小鼠转移至完全无菌环境进行后续实验。
本研究中所用婴儿双歧杆菌菌株购自中国工业菌种保藏管理中心（CICC 6069），菌株保存于20%甘油中和-80℃的环境中。实验开始前，将这些菌株在37℃的双歧杆菌MRS肉汤培养基（Hopebio，中国）中进行两次过夜培养。随后，在4℃环境下以8000g离心力离心10分钟，离心后将细胞沉淀重新悬浮于PBS中，细胞密度为1×108 CFU/mL。实验期间，小鼠灌胃婴儿双歧杆菌悬浮液的剂量为200μL/次/天。
16S rDNA分析
为评估肠道微生物清除情况，使用DNeasy PowerSoil Pro试剂盒（货号47016，QIAGEN，德国）从粪便样本中提取总16S rDNA。随后，对细菌16S rRNA基因进行扩增，采用的正向引物序列为5′-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′，反向引物序列为5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3′。为定量婴儿双歧杆菌，采用特异性引物，其中正向引物序列为5′-ATACAGCAGAACCTTGGCCT-3′，反向引物序列为5′-GCGATCACATGGACGAGAAC-3′。利用KAPA SYBR FAST试剂盒（货号KK4601，KAPA，美国）在7500 Fast Real-Time PCR系统上进行实时定量PCR分析。最后，通过应用从大肠杆菌DNA连续稀释中获得的16S rDNA标准曲线，测定扩增出的DNA数量。
体内缺血/再灌注模型与超声心动图（Echo）检测
为建立体内缺血/再灌注小鼠模型，使用2%异氟醚对小鼠进行麻醉后，于第四肋间精确打开胸腔并小心打开心包膜。随后，使用丝线结扎左冠状动脉前降支（LAD）40分钟后，松开以实现缺血区域的再灌注。
采用Visual Sonics Vevo 3100成像系统（Visual Sonics）配合30MHz探头（型号MX400）进行经胸超声心动图检测，以评估缺血/再灌注（I/R）后小鼠心脏功能恢复情况。检测过程中，小鼠持续吸入含有1.5%异氟醚的100%纯氧以维持麻醉状态。在乳头肌水平位置获取二维靶向M型轨迹图像，并使用专业心脏超声心动图软件精确测量左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）、左室舒张末期内径（LVEDD）及左室收缩末期内径（LVESD）等多项关键指标。为确保数据准确可靠，采用Image J（Image J2，Fiji）软件对三个独立心动周期的数据进行分析与计算。
心脏组织分析
将小鼠心脏组织固定在4%多聚甲醛（PFA）（货号DF0131，莱恩生物）中，随后使用梯度酒精脱水，石蜡包埋，并精细切割成5微米厚的切片。切片经二甲苯脱蜡后，在乙醇中完成复水步骤。本实验采用TUNEL染色法（TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，A113-03，Vazyme，中国）探究细胞凋亡情况。同时，通过天狼猩红染色法和马松三色染色法评估心脏纤维化状况。天狼猩红染色时，复水后的切片在室温下于天狼猩红染料（货号DC0041，中国莱恩生物科技有限公司）中孵育60分钟，随后用Weigert铁苏木精（货号ZLI-9610，中国中杉金桥）染色10分钟。切片经流水冲洗后，通过乙醇系列和二甲苯脱水，最后用中性树胶（货号N116470，中国阿拉丁）封片。马松三色染色则在切片复水后，将其于Weigert铁苏木精中浸泡10分钟，室温下用Biebrich猩红-酸性品红（TRM-1三色染色试剂盒，美国Scy Tek）染色15分钟，再在室温下用磷钨酸-磷钼酸溶液（1:1比例，TRM-1试剂盒，Scy Tek）孵育5分钟，苯胺蓝溶液中浸泡10分钟，1%醋酸处理1-2分钟后，进行乙醇系列和二甲苯脱水，并用中性树胶封片。采用Axio Observer Z1广域显微镜捕捉切片图像，通过Image J（Image J2，Fiji）软件分析，蓝色区域明确指示心脏纤维化区域。
心脏组织免疫组织化学染色检测时，将复水后的切片在室温下用3% H2O2孵育10分钟，随后用柠檬酸钠缓冲液进行抗原去除。切片在封闭缓冲液（含5%牛血清，货号A8020，索莱宝）中处理1小时后，于4℃环境下用专门针对IL-1β（比例1:200，货号16806-1-AP，普洛麦格）的一抗过夜孵育。次日，切片经三次PBS洗涤，每次10分钟后，室温下与生物素化山羊抗兔二抗（SP-0022 SP试剂盒，博奥森）共同孵育1小时，随后用链霉亲和素辣根过氧化物酶（HRP）（SP-0022试剂盒，博奥森）处理30分钟。为可视化切片，使用3，3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）（货号8059，Cell Signaling，美国）显色，苏木精复染，最后进行脱水和封片。为确保实验严谨性，使用IgG作为一抗制备阴性对照。利用Olympus显微镜IX73捕捉染色切片图像，并通过Image J软件对IL-1β信号进行量化分析。
高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）检测肌苷浓度
采用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）检测心脏组织中的肌苷水平。将心脏组织样本于甲醇中提取制备供试品。分析系统为Agilent 1290 Infinity II LC系统，并与Agilent 6495三重四极杆LC/MS（型号：Agilent 1290-6495，Agilent Technologies，USA）相连接。色谱柱为3.5 μm的ZORBAX Eclipse Plus C18（尺寸为100mm × 2.1mm，日本东京）。流动相由100%乙腈（溶剂A）和100%水（溶剂B）混合而成。线性洗脱程序为：从初始的30%溶剂A和70%溶剂B（t = 0分钟）逐渐调整至100%溶剂A（t = 70分钟）。流动相流速为0.8 mL/min，柱温箱温度为30℃。
RNA测序
采用Illumina Stranded mRNA Prep试剂结合Illumina（加利福尼亚州圣地亚哥）的连接技术以构建测序文库。根据文库的有效浓度及所需数据量，在Illumina平台上，采用PE150策略（美吉生物医药科技有限公司，中国上海）对筛选合格的文库进行测序。测序数据分析使用R包DESeq2（版本1.12.3）筛选差异表达基因（DEG）。将差异表达倍数设定为2倍作为鉴定DEG的标准，并应用校正后的p值0.05（基于Benjamini-Hochberg方法）以确保鉴定的准确性。此外，通过R Stats软件包（版本3.6.2）中的prcomp函数对所有经过处理的检测基因进行主成分分析（PCA）。利用R包ggplot2（版本3.4.2）绘制火山图和直方图，并使用R包pheatmap（版本1.0.12）生成热图。借助R和clusterProfiler包（版本3.18.1）进行GO的富集分析，并利用ComplexHeatmap包（版本2.10.0）对GO富集结果进行了可视化展示。GSEA通过使用clusterProfiler分析和GseaVis进行可视化。
酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞因子水平
在实验的不同时间点从小鼠颌下静脉采集血液样本，以检测血清中的细胞因子水平。采集的血液样本在4℃条件下静置4小时后，以1000 g的力离心10分钟。离心后，收集上清液中的血清用于检测分析。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，检测血清中的心肌肌钙蛋白T（cTnT，F7649B，宇通生物，中国）、白细胞介素-1β（IL-1β，RK00006，爱博泰克，中国）以及白细胞介素-6（IL-6，RK00008，爱博泰克，中国）的含量水平。
流式细胞仪分析心脏免疫细胞
本实验通过制备小鼠心脏的单细胞悬液，采用流式细胞仪分析了心脏免疫细胞。向小鼠心脏注入特定配方的EDTA缓冲液（包含130 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.5 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose, 10 mM BDM, 10 mM Taurine, 5 mM EDTA）后，打开心脏腔内的下腔静脉。随后，在夹闭主动脉后，分离心脏，并依次使用EDTA缓冲液、灌注缓冲液（包含130 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.5 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose, 10 mM BDM, 10 mM Taurine, 1 mM MgCl2）以及胶原酶缓冲液（含有0.5 mg/mL的胶原酶2和胶原酶4，编号分别为LS004176和LS004188，美国Worthington）进行灌注处理。随后，用镊子轻柔地将心脏组织分解成1 mm3大小的小块，并在移除夹子后，将其置于含有胶原酶缓冲液的培养皿中，通过轻轻吹打实现组织的解离。经过1小时消化后，加入终止缓冲液（灌注缓冲液中加入无菌FBS）使酶失活。将细胞悬液通过100 μm的滤网过滤，过滤后的心肌细胞静置20分钟进行重力沉降。接着，收集含有包括免疫细胞在内的其他类型细胞的上清液，并在4℃条件下以300 g的离心力离心5分钟。将离心后得到的细胞沉淀重悬于80 μL的PBS中，以备后续分析。在4℃下，先用Fcg阻断抗体抗小鼠CD16/32处理细胞10分钟，随后用单克隆抗体染色30分钟。在流式细胞仪分析中，我们利用CD45+作为所有免疫细胞的共同标记。中性粒细胞用CD11b+ Ly6Ghigh标记，而CD11b+巨噬细胞则用CD11b+ F4/80+标记。此外，DC和NK细胞分别用CD11c+ I-Ab+ Ly6C-Ly6G-和NK1.1+ CD3-进行标记。所有样本均在BD Biosciences的FACS Canto II细胞分析仪上进行检测分析，并使用FlowJo 10.8.1软件对获取的数据进行深入分析。
本次分析所用抗体包括Fcg阻断抗体抗小鼠CD16/32、BV421抗小鼠CD45、BV510抗小鼠CD11b、APC抗小鼠CD3、BV605抗小鼠Ly6C、FITC抗小鼠Ly6G、PE抗小鼠F4/80、PE抗小鼠NK1.1、PE抗小鼠CD11c以及APC抗小鼠I-Ab，这些抗体均购自Biolegend（美国）。
氧葡萄糖剥夺/再氧化（OGDR）实验
C2C12小鼠成肌细胞在增殖培养基（简称PM）中进行培养，该培养基以Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，BI）为基础，并添加了10%的胎牛血清和1%的青链霉素（BI）。在细胞增殖阶段，以2×105个细胞/mL的密度将细胞接种于PM中。对于常氧组，细胞被置于常规培养箱中，并使用PM培养10小时。而对于OGDR组，细胞则被置于AVATAR培养箱（由XCell Biosciences，美国制造）中，在特定气体环境（0.1% O2、5% CO2、94.9% N2）下培养8小时，此阶段使用的DMEM培养基中去除了FBS和葡萄糖。随后，这些细胞被转移到常氧环境下，继续培养2小时。
细胞活力测定
细胞活力测定实验将细胞从培养基或冲洗液中取出，向96孔板的每个孔中加入100 μL的Alamar Blue溶液（用PBS稀释为10%浓度溶液，货号为A7631，Solarbio，中国），之后将板在37℃的温度下孵育2小时。孵育结束后，使用Cytation 5酶标仪（Agilent，美国），设置激发/发射波长为545/590nm进行荧光强度测定。对于细胞死活测定部分，向每个孔（特指96孔板）中加入100μL的Calcein-AM/碘化丙啶（PI）溶液（终浓度1 μM Calcein-AM和1 μg/mL PI），加入后在37℃下孵育0.5小时。随后同样使用Cytation 5荧光检测，此时Calcein的激发/发射波长设定为494/517 nm，而PI的激发/发射波长设定为535/617 nm。最后，使用Andor DragonFly 600来捕获相关的实验图像。
siRNA介导的基因敲降
本实验使用ON-TARGET plus对照siRNA（JTSBI，中国）在C2C12成肌细胞中进行siRNA介导的靶基因敲降，序列如下：
siNC：5′-GCUUGUUGCAAAUAUGCUAUC-3′;
siRNA-Pgm2：5′-CGAGUUUCCAACUGUCAAAUA-3′;
siRNA-Prps1：5′-GCUUGUUGCAAAUAUGCUAUC-3′;
siRNA-Hprt1：5′-CGUUUGUGUCAUUAGUGAAAC-3′;
siRNA-Aprt：5′-GCGGCAAGAUCGACUACAUCG-3′.
根据制造商说明，使用JetPrime转染试剂（101000046，Polyplus，法国）在C2C12成肌细胞中转染siRNA。
RNA提取与RT-PCR
使用TRIzol Regent（15596018，Thermo Fisher Scientific，美国）从小鼠的细胞或心脏组织中提取总RNA。使用RevertAid Master Mix（M1631，Thermo Fisher Scientific，美国）进行第一链cDNA合成。使用TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（RR420D，Takara，日本）获取PCR扩增产物。将基因的mRNA水平归一化为18s或Gapdh的水平。用于定量RT-PCR的引物序列如下：
Pgm2 Fw: 5′-AGTGAAGACGCAGGCATATCC-3′;
Pgm2 Re: 5′-GGCTCCACGGTAGAGACGA-3′;
Prps1 Fw: 5′-ACTTATCCCAGAAAATCGCTGAC-3′;
Prps1 Re: 5′-CCACACCCACTTTGAACAATGTA-3′;
Hprt1 Fw: 5′-CAAACTTTGCTTTCCCTGGT-3′;
Hprt1 Re: 5′-TCTGGCCTGTATCCAACACTTC-3′;
Aprt Fw: 5′-CCCTCTTGAAAGACCCGGAC-3′;
Aprt Re: 5′-CTGCGATGTAGTCGATCTTGC-3′;
Tnf Fw: 5′-CACAGAAAGCATGATCCGCGACGT-3′;
Tnf Re: 5′-CGGCAGAGAGGAGGTTGACTTTCT-3′;
18s Fw: 5′-GCTTAATTTGACTCAACACGGGA-3′;
18s Re: 5′-AGCTATCAATCTGTCAATCCTGTC-3′;
Gapdh Fw: 5′-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3′;
Gapdh Re: 5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3′.
高效液相色谱法检测AMP
根据制造商说明，使用相应的含量检测试剂盒（Solarbio，BC1024）测定C2C12成肌细胞的腺苷酸单磷酸（AMP）含量。使用带有紫外检测器的Agilent 1260 HPLC系统（Agilent Technologies，美国）进行高效液相色谱（HPLC）分析。色谱柱为Diamonsil Plus C18柱（5 µm，250 mm × 4.6 mm）。
ATP检测
在样品制备阶段，向每个细胞培养孔或40 mg的心脏组织样本中加入200 μL的裂解缓冲液进行匀浆处理。随后，将裂解物在4ºC的环境下以12,000 g的离心力离心5分钟。离心完成后，收集上清液，并采用ATP测定试剂盒（S0026，碧云天，中国）检测细胞或心脏组织中的ATP水平。使用BioTek Cytation 7多功能酶标仪（安捷伦，美国）记录ATP的发光强度。最后，通过BCA蛋白测定试剂盒（P0012，碧云天，中国）检测ATP的具体水平，单位为nmol/mg。
统计分析方法
统计分析采用GraphPad Prism 8.4软件完成。在进行两组之间的对比时，根据具体情况选择使用双尾非配对Student's t检验。当需要对比超过两组数据时，我们则运用单因素或双因素方差分析（ANOVA），并在此之后实施Tukey检验或Dunnett检验。数据呈现为平均值 ± 标准误差。若p值小于0.05，即认为差异具有统计学意义。
代码和数据可用性
我们已将所有的测序数据提交至NCBI数据库，其提交编号为CRA016606，该编号对应的是转录组测序项目。同时，这些数据也与BioProject相关联，其检索号为PRJCA026354，具体链接为：https://ngdc.cncb.ac.cn/bioproject/browse/PRJCA026354。此外，我们已将研究过程中使用的数据和脚本上传至GitHub平台，方便大家查阅和复用，链接地址为：https://github.com/xpf10/inosine。若需要查阅补充材料，包括图表、表格、脚本、图形摘要、幻灯片、视频，以及中文版材料和后续更新内容，可通过在线DOI访问，或者直接浏览iMeta Science网站：http://www.imeta.science/。
引文格式：
Zhang, Hao, Jiawan Wang, Jianghua Shen, Siqi Chen, Hailong Yuan, Xuan Zhang, Xu Liu, et al. 2024. “Prophylactic supplementation with Bifidobacterium infantis or its metabolite inosine attenuates cardiac ischemia/reperfusion injury.” iMeta e220. https://doi.org/10.1002/imt2.220
作者简介
张浩（第一作者）
● 中国科学院动物研究所在读博士。
● 目前研究方向为心肌缺血再灌注损伤机制及心脏保护，相关学术成果已发表于iMeta、Advanced Science等期刊。
王佳琬（第一作者）
● 首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉科副主任医师，讲师。
● 2011-2012在美国加州大学圣迭戈分校麻醉学系访问学者，2014年获得首都医科大学麻醉学博士学位，2021-2024年在中科院动物所器官再生与智造国家重点实验室进行心血管相关疾病的基础科学研究。目前任中国心胸血管麻醉学会心血管麻醉分会青年委员、北京麻醉学会神经科学学组秘书、Anesthesiology中文版青年编委。主持国自然青年基金一项，参与国自然面上项目三项，入选北京市医院管理中心“青苗计划”及“优秀临床青年计划”。以第一作者在iMeta、Advanced Science, Anesthesiology等期刊上发表SCI论文十余篇。
沈江华（第一作者）
● 中国科学院动物研究所在读博士。
● 目前研究方向为缺血性心脏病的机制及干预研究，相关学术成果已发表于iMeta等期刊。
王军（通讯作者）
● 中国科学院微生物研究所研究员。
● 长期从事微生物组相关技术和转化研究，主要成果包括应用人工智能方法高通量发现微生物源新型抗菌多肽、结合最新三代测序技术在菌株水平精细解析微生物组代谢潜力、在自身免疫性疾病研究中发现微生物组发挥作用的关键“致病”和“治病”蛋白成分等。主持国家“病原学与防疫技术体系研究”重点专项、重点研发计划项目、重大研究计划培育项目等。近五年，以最后或共同通讯作者身份在Nat Biotechnol、Cell Host Microbe、Nat Commun、Adv Sci等期刊发表SCI论文45篇。曾获“中国科学院优秀导师”、“2023年中源协和生命医学创新突破奖”等奖项。
宋默识（通讯作者）
● 中国科学院动物研究所研究员，博士生导师，Life Medicine / Translational Medicine of Aging编委。
● 主要从事心脏衰老及相关疾病的机制与干预研究。曾获中国科学院百人计划、国家海外高层次青年人才项目、国家优青、北京市杰青项目支持，主持科技部重点研发计划青年项目、国家自然科学基金重大研究计划培育项目、国家自然科学基金面上项目等。
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3卷1期
2卷2期封底
2卷4期封底
3卷2期
3卷3期
3卷3期封底
期刊简介
“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、ESCI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.7，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！
“iMetaOmics” 是“iMeta” 子刊，主编由中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员和香港中文大学于君教授担任，是定位IF>10的高水平综合期刊，欢迎投稿！
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